PREPARACIÓN Y USOS DE:AGUA DE PEPTONA ,MR-VP O VORGES PROSKAUER Y AGAR CITRATO

Agua Peptonada.

Medio usado como diluyente y para enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos y otros materiales de interés sanitario.

Fundamento 

Medio de enriquecimiento no selectivo, recomendado para ser utilizado en lugar de solución fisiológica para recuperar células de enterobacterias dañadas por procesos fisicoquímicos, a los que ha sido sometido el alimento. Si es utilizado como medio base para la fermentación de hidratos de carbono, se debe adicionar el indicador de Andrade y el hidrato de carbono en cuestión.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Peptona de carne	10.0	Suspender 15 g de polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar bien y distribuir. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
Cloruro de sodio	5.0
pH final: 7.2 ± 0.2

SiembraPor inoculación directa del material en estudio.
Como diluyente: realizar las diluciones 1:10 y 1:100, dependiendo del uso que se le quiera dar.


Incubación Aeróbica, a 35-37 ºC durante 18-24 horas.

Resultados

Microorganismos	Crecimiento
Escherichia coli ATCC 25922	Bueno
Staphylococcus aureus ATCC 25923	Bueno
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	Bueno
Control Negativo	Resultado
Medio sin inocular	Sin cambio

MR-VP Medio


Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskáuer.
Es particularmente útil para la clasificación de enterobácterias.

Fundamento
En el medio de cultivo, la pluripéptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable.
La glucosa puede ser metabolízada por los microorganismos, a través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol).
Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos, y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros.
Voges y Proskáuer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de adicionar hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloración se debe a la oxidación del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Pluripeptona	7.0	Suspender 17 g del polvo por litro de agua destilada. Calentar suavemente agitando hasta disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.
Glucosa	5.0
Fosfato dipotásico	5.0
pH final: 6.9 ± 0.2

Siembra
Por inoculación directa, a partir del cultivo en estudio.

Incubación
En aerobiosis, a 35-37°C por 3 días.

Microorganismo	Crecimiento	RM	VP
E. coli ATCC 25922	Bueno	+	-
K. pneumoniae ATCC 700603	Bueno	-	+
P. mirabilis ATCC 43071	Bueno	+	-
S. typhimurium ATCC 14028	Bueno	+	-
Citrobacter freundii	Bueno	+	-
Enterobacter aerogenes	Bueno	-	+

Simmons Citrato Agar

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Citrato de sodio	2.0	Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en posición inclinada.
Cloruro de sodio	5.0
Fosfato dipotásico	1.0
Fosfato monoamónico	1.0
Sulfato de magnesio	0.2
Azul de bromotimol	0.08
Agar	15.0
pH final: 6.9 ± 0.2

Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar.

Incubación
A 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis.
Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días de incubación.

Microorganismo	Citrato permeasa	Color del medio
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603	Positivo	Azul
S. typhimurium ATCC 14028	Positivo	Azul
E. coli ATCC 25922	Negativo	Verde
S. flexneri ATCC 12022	Negativo	Verde

Limitaciones
-Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado.
Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualización azul de un resultado positivo.
-Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.
-Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculación antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgánica puede originar resultados falsos positivos.

Características del medio
Medio preparado: verde.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.